Entwicklung eines neuen Alginats

Wissenschaftliche Berichte Band 12, Artikelnummer: 7213 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Wundheilung ist ein komplexer Prozess und eine schnelle Heilung erfordert eine geeignete Mikroumgebung. Daher ist die Entwicklung und Herstellung eines wirksamen Wundverbandes eine beeindruckende Innovation auf dem Gebiet der Wundheilung. Der in diesem Szenario hergestellte Wundverband wurde unter Verwendung einer Kombination geeigneter koagulierender und antibakterieller Materialien wie Fibrinogen (als koagulierendes Mittel), Nisin (als antibakterielles Mittel), Ethylendiamintetraessigsäure (als antibakterielles Mittel) und Alginat entwickelt (als Wundheilmittel). Die biophysikalische Charakterisierung zeigte, dass die Wechselwirkung von Fibrinogen und Alginat mit geringfügigen Veränderungen in der Sekundärstruktur des Proteins verbunden war. Konformationsstudien zeigten, dass das Protein bei 42 °C, der maximalen Temperatur der infizierten Wunde, strukturell stabil war. Bewertet wurden die Eigenschaften des Hydrogels wie Schwellung, mechanischer Widerstand, Nisinfreisetzung, antibakterielle Aktivität, Zytotoxizität, Gelporosität und Blutgerinnung. Die Ergebnisse zeigten eine langsame Freisetzung des Nisins innerhalb von 48 Stunden. Antibakterielle Studien zeigten eine hemmende Wirkung auf das Wachstum gramnegativer und grampositiver Bakterien. Aufgrund seiner ausreichenden Porosität war das Hydrogel außerdem in der Lage, eine beträchtliche Menge Wasser zu absorbieren und für eine Sauerstoffanreicherung sowie den Einbau des Arzneimittels in seine Struktur zu sorgen. Rasterelektronenmikroskopische Untersuchungen zeigten Porengrößen von etwa 14–198 µm im Hydrogel. Studien zur Zelllebensfähigkeit zeigten eine hohe Biokompatibilität des Hydrogels. Der Blutgerinnungstest bestätigte auch die Wirksamkeit des synthetisierten Hydrogels bei der Beschleunigung des Prozesses der Blutgerinnselbildung. In-vivo-Studien zeigten höhere Wundheilungs-, Reepithelisierungs- und Kollagenablagerungsraten. Den Erkenntnissen aus In-vitro- und In-vivo-Studien zufolge kann das entwickelte Hydrogel nach weiteren Prüfungen der Voraussetzungen als neuartiger attraktiver Wundverband angesehen werden.

Die Haut als größtes Organ des Körpers ist in der Lage, den Körper und seine Bestandteile zu schützen, indem sie als Barriere gegen mechanische und mikrobielle Schäden fungiert1. Daher stellen Hautschäden oder Wunden heutzutage ein großes medizinisches Problem dar2. Eine Bevölkerung von fast sechs Millionen Menschen weltweit kämpft mit verschiedenen Arten von Wunden, die ihren Lebensstil beeinträchtigen und ihre Lebensqualität beeinträchtigen. Insbesondere bei chronischen Wunden, die schwerwiegend sind und deren Heilung länger als 12 Wochen dauert, kommt es häufig zu Rezidiven. Diese Wunden werden durch bestimmte Krankheiten wie Diabetes und Tumorerkrankungen sowie schwere physiologische Infektionen verursacht3. Daher ist die Gestaltung eines wirksamen Wundverbandes eine wichtige Voraussetzung für die Verbesserung der Wundheilungsrate.

Eine ordnungsgemäße Wundauflage sollte durch einen geeigneten Gasaustausch mit der Umgebung ein günstiges Mikromilieu für die Wundheilung bieten und gleichzeitig für Staubpartikel und Keime nicht durchlässig sein. Eine geringe Haftung an der Wundstelle sowie eine leichte Ablösung von der Wundoberfläche sind weitere Merkmale einer geeigneten Wundauflage4. Bisher wurden verschiedene Wundauflagen entwickelt, darunter Hydrokolloide, Filme, Schäume, Hydrogele usw. Die hydrophile Natur von Hydrogel-Verbänden bietet viele Vorteile wie die Absorption von zusätzlichem Wundsekret, den Schutz der feuchten Umgebung, das Eindringen von Sauerstoff in die Wundstelle und die Schmerzlinderung für den Patienten5.

Jüngste Studien haben die Fähigkeit einiger natürlicher Biopolymere wie Chitosan, Kollagen und Alginat gezeigt, den Wundheilungsprozess zu erleichtern6,7,8,9,10. Es wurde gezeigt, dass ein komplexes Hydrogel aus Chitosan und Alginat, das Fibroblasten-Wachstumsfaktoren/vaskuläres endotheliales Cadherin enthält, die Regeneration von Hautwunden beschleunigt11. Darüber hinaus wurde ein weiteres Chitosan-Alginat-Hydrogel-Komposit mit Nisin entwickelt, das sich als wirksam bei der Heilung akuter Wunden erwiesen hat12. Seit den 1980er Jahren wurde eine große Anzahl von Verbänden, die diese beiden natürlichen Verbindungen enthalten, synthetisiert und zur Behandlung von Hautwunden, insbesondere von Diabetikern, verwendet, was eine der Hauptursachen für die weltweite Sterblichkeit darstellt13. Als stark hydrophiles Kohlenhydrat wird Alginat aus braunen Meeresalgen und Bakterienquellen wie Azotobacter und Pseudomonas gewonnen. Es handelt sich um ein polyanionisches Copolymer, das homopolymere Blöcke aus (1,4)-verknüpften β-D-Mannuronat- (M) und α-L-Guluronat- (G) Resten enthält14,15. Eine der wichtigsten Eigenschaften von Alginat ist seine Neigung zu Metallionen, die zur Herstellung sehr starker Gele beiträgt16. Es ist zu beachten, dass die gebildete Struktur ein entscheidender Faktor für das Einfangen von Zellen, DNA und Proteinen ist14. Darüber hinaus zeichnet sich Alginat durch Nichtimmunogenität, chemische Vielseitigkeit, Kosteneffizienz, geringe Toxizität, biologische Abbaubarkeit, Biokompatibilität, einzigartige Wasserabsorption und bemerkenswerte Vernetzungsfähigkeit aus; Dadurch erlangte Alginat große Aufmerksamkeit in medizinischen Anwendungen, insbesondere in der regenerativen Medizin und der Wundheilung17,18,19.

Andererseits ist eines der wichtigen Ereignisse im Wundheilungsprozess die schnelle Blutgerinnung an der Wundstelle, bei der Fibrinogen eine wichtige Rolle spielt. Fibrinogen ist ein großes (340 kDa) Glykoprotein mit einer Länge von etwa 45 nm, das aus drei Paaren von Polypeptidketten (α2β2γ2) besteht, die durch fünf Disulfidbrücken in der N-terminalen Domäne verbunden sind. Insgesamt stabilisieren 29 Disulfidbindungen innerhalb und zwischen den Ketten das Protein20,21. Fibrinogen und Thrombin sind wichtige Faktoren bei der Blutgerinnung, der Zellanhaftung, Entzündungsreaktionen und der Wundheilung22. Kürzlich wurden selbstorganisierte Fibrinogengerüste mit der möglichen Anwendung in Wundheilungssystemen entwickelt23.

Der andere wichtige Faktor, der bei der Wundheilung berücksichtigt werden sollte, sind bakterielle Infektionen, die heute aufgrund der Entstehung von Antibiotikaresistenzen eine große medizinische Herausforderung darstellen. Nisin ist ein antibakterielles Peptid mit einem Molekulargewicht von 3,3 kDa und 34 Aminosäuren, gehört zur Gruppe A der Lantibiotika und wirkt gegen grampositive Bakterien24,25. Nisin findet zahlreiche Anwendungen in der Lebensmittelkonservierung und Medizin, einschließlich der Wundheilung; Es wirkt gegen einige Bakterienarten wie Staphylococcus aureus und Clostridium difficile26,27. Der Mechanismus der antibakteriellen Wirkung von Nisin beruht auf der Bildung von Poren in der Bakterienzellwand. Obwohl Nisin gegen ein breites Spektrum grampositiver Bakterien wirkt, hat es keine Auswirkungen auf gramnegative Bakterien und Pilze28. Es ist gut dokumentiert, dass Nisin in Gegenwart von Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) eine antibakterielle Wirkung gegen gramnegative Stämme hat25.

Im Hinblick auf die oben genannten Probleme haben wir ein Wundverband-Hydrogel entwickelt, das aus Alginat, Fibrinogen, Nisin und EDTA zur Reparatur von Hautgeschwüren besteht. Wir begannen mit der Untersuchung der Wechselwirkung zwischen Fibrinogen und Alginat, dem Hauptbestandteil des Hydrogels, mithilfe spektroskopischer Techniken. Anschließend haben wir das Hydrogel vorbereitet, optimiert und mit verschiedenen Methoden charakterisiert. Schließlich führten wir In-vivo-Studien durch und testeten den vorbereiteten Hydrogel-Wundverband an Geschwüren von Ratten und beobachteten Verbesserungen im Heilungsprozess.

Der im aktuellen Projekt entworfene Wundverband besteht aus wirksamen Wirkstoffen zur Beschleunigung des Wundheilungsprozesses wie Nisin (antibakterieller Wirkstoff), Fibrinogen (koagulierender Wirkstoff), Calciumalginat (verbessert die Angiogenese und Kollagenbildung) und EDTA (antibakterieller Wirkstoff). Tatsächlich kann das Vorhandensein der genannten Materialien eine geeignete Voraussetzung für eine schnelle und wirksame Wundtherapie darstellen. Nach unserem besten Wissen wurde eine solche Struktur nicht als Wundverband gemeldet. Es ist zu berücksichtigen, dass die Anwesenheit mehrerer antibakterieller Wirkstoffe (z. B. Nisin und EDTA) eine synergistische antibakterielle Aktivität gegen grampositive und negative Bakterien hervorrufen kann. Andererseits wurden in der aktuellen Studie biophysikalische und strukturelle Studien durchgeführt, um Wechselwirkungen zwischen Komponenten des synthetisierten Hydrogels auf molekularer Ebene zu untersuchen und so einen geeigneten Wundverband zu entwerfen. In der schematischen Darstellung in Abb. 1 werden alle Studienmaterialien und Phasen dieser Forschung dargestellt.

Die schematische Darstellung der Materialvorbereitung und -anwendung gibt einen Überblick über die vorliegende Studie. Im ersten Schritt wurden biophysikalische und strukturelle Untersuchungen des Fibrinogenproteins in Gegenwart und Abwesenheit von Alginatpolymer mithilfe von Fluoreszenzspektroskopie, Zirkulardichroismus-Spektroskopie und thermischer UV-Vis-Spektroskopie durchgeführt. Im zweiten Schritt wurde das Hydrogel durch visuelle Auswertung und Rasterelektronenmikroskopie, Fourier-Transformations-Infrarotspektroskopie, Quellverhältnis, mechanische Untersuchung, In-vitro-Nisinfreisetzung, Verkapselungseffizienz, Zytotoxizitätstest, antibakterieller Aktivitätstest und Blutgerinnungstest hergestellt und charakterisiert . Abschließend wurden Tierversuche durchgeführt. Das optimierte Hydrogel wurde auf die Hautwunde von Ratten aufgetragen und der Wundheilungsprozess wurde über 19 Tage beobachtet. (Entworfen von Photoshop CC 2022; http://www.adobe.com/products/photoshop.html).

Alginat mit durchschnittlichen Molekulargewichten von etwa 46 kDa (CAS: 9005-38-3), Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT), Fibrinogen (CAS: 9001-32-5), Rinderserumalbumin (BSA) und Nisin (CAS: 1414-45-5) wurden von Sigma-Aldrich bezogen. NaCl, KCl, Na2HPO4, KH2PO4, CaCl2, Trismethylamin und Formaldehydlösung wurden von Merck bezogen. Dulbeccos modifiziertes Eagles-Medium (DMEM), fötales Rinderserum (FBS) und Trypsin stammten von Gibco. In der aktuellen Studie wurden Alginat und Nisin in doppelt destilliertem Wasser gelöst, Fibrinogen wurde in Natriumphosphatpuffer gelöst.

Die Wirkung von Alginatpolymer auf die intrinsische Fluoreszenz von Fibrinogen wurde mit einem Varian-Kary-Eclipse-Spektrofluorometer bei einer Anregungswellenlänge von 280 nm und Emissionswellenlängen von 300–400 nm bewertet. Während dieser Studien wurde die Fluoreszenzintensität von 0,06 µM Fibrinogen, gelöst in 20 mM Natriumphosphatpuffer, in Gegenwart steigender Alginatkonzentrationen bei 25, 30 und 35 °C gemessen. Die Mischung aus Protein und Alginat wurde vor den Messungen 10 Sekunden lang gevortext und 2 Minuten lang bei Raumtemperatur gelagert29.

Die Sekundärstruktur von 0,72 µM Fibrinogen wurde in Gegenwart und Abwesenheit verschiedener Alginatkonzentrationen bewertet, indem unter Verwendung eines Aviv 215-Spektropolarimeters (Lakewood, New Jersey, USA) bei 25 ° Fern-UV-Spektren (195–260 nm) des Zirkulardichroismus (CD) erhalten wurden C. In diesem Fall wurde Fibrinogen vor den CD-Messungen 10 Minuten lang bei Raumtemperatur mit den genannten Alginatkonzentrationen inkubiert. Für die Fern-UV-CD-Spektroskopie wurden Quarzzellen mit einer Schichtdicke von 1 mm verwendet. Pufferkorrektur, Glättung und Konvertierung in die molare Elliptizität der CD-Daten wurden mithilfe der CDSD-Software durchgeführt. Zur Korrektur des Puffers wurden entsprechende Kontrollen hergestellt, die die verwendeten Alginatkonzentrationen enthielten. Darüber hinaus wurde CDNN-Software eingesetzt, um die Daten zu entfalten und den Inhalt verschiedener Sekundärstrukturelemente zu erhalten30,31.

Die thermische Stabilität von 13,2 µM Fibrinogen in Gegenwart und Abwesenheit von 1,6 mM Alginat (proportional zum Verhältnis der Protein- zur Ligandenkonzentration im synthetisierten Hydrogel) wurde durch UV-sichtbare Spektroskopie untersucht. Die Fibrinogenabsorption bei 280 nm wurde mit dem UV-Vis-Spektrophotometer Cary 100 Bio (Varian, Australien) gemessen. Die Temperatur wurde so programmiert, dass sie um 2 °C pro Minute von 25 auf 60 °C ansteigt, gefolgt von 1 °C pro Minute von 60 auf 90 °C. Schließlich wurden thermische Denaturierungskurven von Fibrinogen in Gegenwart und Abwesenheit verschiedener Alginatkonzentrationen erstellt32.

Eine 4,0 % (Gew./Vol.) Stammlösung von Alginat wurde in doppelt destilliertem Wasser durch Rühren hergestellt, bis eine homogene Lösung erhalten wurde, zu der eine Lösung aus Fibrinogen, EDTA und Nisin hinzugefügt wurde. Dann wurden 150 mM steriles CaCl2 zugegeben und verrührt, um die Gelierung einzuleiten. Die jetzt als Alg-Fib@Nis-EDTA bezeichneten Hydrogelpräparate wurden auf Basis unterschiedlicher Konzentrationen von Nisin (0,03, 0,08 und 0,15 mM) bereitgestellt. Die Endkonzentrationen von Alginat (0,87 mM), Fibrinogen (7,17 μM) und EDTA (50 mM) waren jedoch in den drei Hydrogelpräparaten konstant. Wir bezeichnen das Hydrogel, das nur vernetztes Alginat enthält, im gesamten Manuskript als „Alg-Hydrogel“ und das Hydrogel, das Alginat, Fibrinogen, Nisin und EDTA enthält, als „Alg-Fib@Nis-EDTA-Hydrogel“. Es ist erwähnenswert, dass die zur Herstellung der Gele verwendeten Nisin-, Fibrinogen-, EDTA- und CaCl2-Lösungen durch sterile 0,2-µm-Filter filtriert wurden.

Zunächst wurden die vorbereiteten Hydrogele gefriergetrocknet. Dieser Prozess wurde 24 Stunden lang bei einer Temperatur von −50 °C und einem Druck von 1 mbar durchgeführt, um die Hydrogele zu trocknen. Anschließend wurde das gefriergetrocknete Hydrogel mit einer Goldschicht beschichtet, bevor es mit einem TE-SCAN-Feldemissions-Rasterelektronenmikroskop (FE-SEM) analysiert wurde, das bei 20 kV betrieben wurde. Die Porengrößen wurden mit der Software ImageJ (Version 1.53a)33 bestimmt.

Fourier-Transformations-Infrarotspektroskopie (FT-IR) wurde mit einem FT-IR-Spektrophotometer (AVATAR, Bereich von 4000 bis 400 cm−1, Thermo, USA) mit einer Auflösung von 2 cm−1 unter Verwendung von KBr-Pellets durchgeführt34.

Dieser Test wurde durchgeführt, um den maximalen Prozentsatz der Hydrogel-Wasserabsorption in simulierter Wundflüssigkeit (SWF) zu bestimmen. Der SWF enthielt 2,0 % BSA, 0,02 M CaCl2, 0,4 M NaCl und 0,08 M Tris-Puffer in entionisiertem Wasser (pH 7,5). Die Gewichtsveränderungen des Alg-Fib@Nis-EDTA-Hydrogels wurden alle 20 Minuten über einen Zeitraum von 240 Minuten gemessen. Das gequollene Hydrogel wurde alle 20 Minuten vorsichtig entnommen und auf ein Filterpapier gelegt, um das umgebende Wasser zu entfernen, und dann gewogen. Die Experimente wurden jeweils dreifach bei drei Temperaturen (25, 37 und 42 °C) durchgeführt. Das Quellverhältnis (%) wurde mithilfe der folgenden Gleichung (Gleichung 1) berechnet:

wobei Wd und Ws die Gewichte des Hydrogels vor bzw. nach der Hydratation darstellen35.

Die gefriergetrockneten Hydrogele wurden zunächst in PBS getaucht, damit sie gelartig wurden. Anschließend wurden die einachsigen Kompressionstests durchgeführt, um die mechanischen Eigenschaften bei einer Geschwindigkeit von 5 mm/min zu untersuchen. Die Drucktests wurden an zylindrischen Proben mit einem Anfangsdurchmesser von 15 mm und einer Anfangslänge von 10 mm unter Verwendung einer SANTAM™-Universalprüfmaschine durchgeführt. Die Experimente wurden an gequollenem Hydrogel bei drei Temperaturen (25, 37 und 42 °C) jeweils dreifach durchgeführt36.

Die Freisetzung von Nisin aus dem Alg-Fib@Nis-EDTA-Hydrogel wurde durch Messung seiner Absorption bei 212 nm und anschließende Bestimmung seiner Konzentration mithilfe einer Standardkurve berechnet. Der Freisetzungsprozentsatz wurde anhand der folgenden Gleichung berechnet (Gleichung 2):

Dabei ist das „freigesetzte Nisin“ gleich der Menge an Nisin, die in verschiedenen Zeitintervallen im Gesamtvolumen der Lösung vorhanden ist, und das „Gesamt-Nisin“ ist gleich der anfänglichen Menge an Nisin, die in das Hydrogel geladen wurde. Darüber hinaus wurde als Kontrolle auch die Freisetzung des freien Nisins (nicht in das Hydrogel eingebaut) bestimmt. Die Freisetzung von freiem Nisin wurde gemessen, indem eine Lösung von freiem Nisin in der gleichen Konzentration wie das mit Nisin beladene Hydrogel in einen Dialysebeutel gegeben und in Phosphatpuffer gegeben wurde. Anschließend wurde die Freisetzung von freiem Nisin während 48 Stunden bestimmt. Alle Experimente wurden dreifach durchgeführt34.

Um die Effizienz der Nisin-Einkapselung zu messen, wurden 50 mg Alg-Fib@Nis-EDTA-Hydrogel in 50 ml PBS (pH 7,4) getaucht und 30 Minuten lang gerührt. Anschließend wird erneut 4 h mit Hilfe eines Magneten bei 1000 U/min gerührt. Nach 30-minütiger Zentrifugation bei 4000 U/min wurde die Absorption des Überstands bei 212 nm analysiert. Alle Experimente wurden dreifach durchgeführt. Der Verkapselungsprozentsatz wurde mithilfe der folgenden Gleichung34 (Gleichung 3) berechnet.

Die menschliche Epidermiszelllinie A431 wurde von der National Cell Bank of Iran (Pasteur Institute, Iran) erworben. Die Zellen wurden in DMEM, ergänzt mit 10 % hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum (FBS) und 1,0 % Penicillin- und Streptomycinlösung, kultiviert. Die Zellen wurden als Monoschicht kultiviert und bei 37 °C mit 5,0 % CO2 und 95 % feuchter Atmosphäre inkubiert. A431-Zellen wurden unter Verwendung von 0,25 % (Gew./Vol.) Trypsin zusammen mit 0,03 % (Gew./Vol.) EDTA in PBS subkultiviert, um die Zellen abzulösen.

Die Zytotoxizität der Hydrogele wurde mittels MTT-Assay untersucht. A431-Zellen wurden mit 20.000 Zellen/cm2 in Platten mit 96 Vertiefungen kultiviert und vor den Behandlungen 24 Stunden lang inkubiert. In der Zwischenzeit wurde der Hydrogelextrakt mit 1,0 mg Hydrogelen, die 0,03, 0,08 und 0,15 mM Nisin enthielten, in 1 ml DMEM bei 37 °C für 24 Stunden hergestellt. Dann wurde das Kulturmedium abgesaugt und 100 μl Hydrogelextrakt mit unterschiedlichen Nisinkonzentrationen in jede Vertiefung gegeben. Nach 24- und 48-stündiger Inkubation wurden die Medien entfernt und die Zellen 4 Stunden lang mit frischem Medium, das 0,5 mg/ml MTT enthielt, inkubiert. Anschließend wurde das Medium entfernt und 200 µl DMSO zusammen mit 25 µl Sorensens Glycinpuffer (enthaltend Glycin, NaCl) hinzugefügt , und KCl). Mit einem BioTek Elisa-Lesegerät wurde die Absorption bei 570 nm gemessen, gefolgt von der Berechnung der Zelllebensfähigkeit basierend auf der folgenden Gleichung37 (Gleichung 4):

Es wurden Platten vorbereitet, die LB-Agar-Kulturmedium mit einer Konzentration von 37 mg/L enthielten, gefolgt von der Aussaat von grampositivem Staphylococcus aureus (ATCC 25923) und gramnegativem Escherichia coli (ATCC 25922). Dann wurden sterile, im Handel erhältliche Scheiben, die mit Alg-Fib@Nis-EDTA- und Alg-Fib@Nis-Hydrogelproben (ohne EDTA) imprägniert waren und verschiedene Nisinkonzentrationen enthielten, zusammen mit Alg-Fib-Hydrogel ohne Nisin und EDTA als Kontrolle auf den Agar gelegt Platten ansetzen und über Nacht bei 37 °C inkubieren. Um die Wirkung der Vernetzung auf die antibakteriellen Eigenschaften des synthetisierten Hydrogels zu bewerten, wurden dieselben Proben auch nach Zugabe von CaCl2 als Vernetzungsmittel und Gelbildung getestet. Dementsprechend wurden die Gele nach der Herstellung des Gels in gleich große antibakterielle Scheiben geschnitten, auf die Agarplatten gelegt und über Nacht bei 37 °C inkubiert. Schließlich wurde der Durchmesser der Hemmzone um die Scheiben und die Gele gemessen38.

Die minimale Hemmkonzentration (MHK) und die minimale bakterizide Konzentration (MBC) von Nisin auf Staphylococcus aureus (ATCC 25923) und Escherichia coli (ATCC 25922) wurden bestimmt. Reinkulturen der Bakterien wurden in Müller-Hinton-Agar hergestellt. Eine Kolonie jeder Kultur wurde in die Müller-Hinton-Brühe mit einer Konzentration von 1,0 × 108 KBE/ml gemäß dem McFarland-Standard übertragen, gefolgt von der Aussaat der Bakterien in Platten mit 96 Vertiefungen (jede Vertiefung enthielt 100 µl mikrobielle Stammlösung). Zur Bestätigung der Anzahl der verwendeten Bakterien wurde eine Qualitätskontrollanalyse durchgeführt. Anschließend wurden die Bakterien mit den Alg-Fib@Nis-EDTA-Hydrogelen (enthaltend 0,03, 0,08 und 0,15 mM Nisin), 7,17 μM Fibrinogen allein und 50 mM EDTA allein behandelt. Negativ- und Positivkontrollvertiefungen, die nur das Kulturmedium (ohne Mikroben- oder Arzneimittelvorräte) bzw. den Mikrobenvorrat zusammen mit dem Kulturmedium enthielten, wurden ebenfalls einbezogen. Nach 16-stündiger Inkubation bei 37 °C wurde das Bakterienwachstum durch Aufzeichnung der OD600 mit einem UV-Vis-Spektrophotometer und der Negativkontrolle als Blindwert überwacht39,40.

Um die Beteiligung des in den vorbereiteten Hydrogelen vorhandenen Fibrinogens an der Blutgerinnung zu untersuchen, wurde ein Blutgerinnungstest durchgeführt. Drei Wundverbandproben mit den Abmessungen 3,5 × 3,5 cm (einschließlich Gaze, Alg-Hydrogel und Alg-Fib@Nis-EDTA-Hydrogel) wurden jeweils in eine Kulturschale gegeben und bei 37 °C in einem Thermoschüttler inkubiert, gefolgt von der Zugabe von 200 μl Blut. Anschließend wurden jeder Probe 20 μl 0,2 M CaCl2 zugesetzt, um die Koagulation zu starten. Nach 10-minütigem Schütteln der Proben bei 37 °C und 30 U/min wurden jeder Probe 25 ml entionisiertes Wasser zugesetzt, um die roten Blutkörperchen zu hämolysieren, die nicht am Gerinnungsprozess beteiligt waren. Die resultierende Lösung wurde spektroskopisch untersucht, indem die Adsorption bei 540 nm aufgezeichnet wurde. Das Experiment wurde für jede Probe dreimal wiederholt41.

Tierversuche wurden nach Genehmigung durch die Ethikkommission der Medizinischen Universität Teheran (Ethikkodex IR.UT.SCIENCE.REC.1400.003) durchgeführt. Die Wirksamkeit des Hydrogel-Verbandes wurde am Wistar-Rattenmodell mit einem Gewicht von 200–250 g bestimmt. Die Gesamtzahl der Versuchsratten betrug 36, die in drei Gruppen zu je 12 aufgeteilt wurden. Die Gruppen umfassten: Kontrolle, Alg-Hydrogel und Alg-Fib@Nis-EDTA-Hydrogel. Alle Ratten wurden unter Standardbedingungen in ähnlichen Käfigen gehalten und mit Rattenfutter und Wasser gefüttert. Zunächst wurden die Ratten im Verhältnis 80:20 durch intraperitoneale Injektion von Ketaminhydrochlorid (50 mg/kg, ChemiDarur, Iran) und Xylosin (5 mg/kg ChemiDarur, Iran) anästhesiert, gefolgt von der Rasur der Haare auf dem Rücken Ratten mit einem Rasiermesser und mit sterilen chirurgischen Skalpellen eine 15 mm große Wunde in voller Dicke von 3 cm × 3 cm erzeugen. Die Einschnitte wurden im dorsalen Lendenbereich, 1,5 mm von der Mittellinie entfernt, auf dem Rücken von Ratten angelegt. Schließlich wurden die Ratten in drei separate Gruppen eingeteilt und die Wunden jeder Gruppe mit einem speziellen Verband für diese Gruppe (3,5 cm × 3,5 cm und 2 mm dick) abgedeckt und mit steriler Gaze und einem elastischen Klebeverband fixiert. Die Kontrollwunden wurden lediglich mit steriler Gaze und elastischem Pflaster abgedeckt. Die Ratten wurden in getrennten Käfigen untergebracht. Die Wundgröße wurde am ersten, dritten, siebten und vierzehnten Tag fotografiert und mit der ImageJ-Software gemessen. Die Wundreduktion wurde nach folgender Gleichung berechnet (Gl. 5):

Dabei ist A0 die ursprüngliche Wundfläche und At die Wundfläche nach dem Zeitintervall t42.

Um die Histopathologie der Wunden zu untersuchen, wurden am 3., 7., 14. und 19. Tag des Experiments drei Ratten jeder Gruppe ausgewählt. Die Ratten wurden mit 300 mg/kg Körpergewicht Ketamin zusammen mit 20 mg/kg Körpergewicht Xylazin eingeschläfert. Herzfrequenz, Mydriasis und Atmung wurden 15 Minuten nach der Injektion untersucht, um den Tod der Tiere zu bestätigen. Anschließend wurden die Hautgewebe entnommen und sofort 48 Stunden lang in 10 % neutral gepuffertem Formalin (pH 7,26) fixiert. Die fixierten Gewebeproben wurden verarbeitet, in Paraffin eingebettet und auf 5 mm Dicke geschnitten. Abschließend wurden die Schnitte mit Hämatoxylin und Eosin (H&E) und Masson-Trichrom (MT) gefärbt. Die histologischen Objektträger wurden von einem unabhängigen Gutachter mittels Lichtmikroskopie (Olympus BX51; Olympus, Tokio, Japan) bewertet. Epithelisierung und Fibroplasie wurden in verschiedenen Gruppen vergleichend bewertet. Die Epithelisierung am 19. Tag wurde semiquantitativ auf 3 Objektträgern in jeder Gruppe beurteilt: 0 (ohne neue Epithelisierung), 1 (25 %), 2 (50 %), 3 (75 %) und 4 (100 %). Für diese Parameter wurden die Ergebnisse durch vergleichende Analyse eines unabhängigen Beobachters validiert, der für die Behandlungsgruppen blind war. Bezüglich des Kollagengehalts und der damit verbundenen Quantifizierungsmethode wurde eine 200-fache Vergrößerung zur Bewertung der Proben für dieses Kriterium verwendet und die Berechnung wurde für drei mikroskopische Objektträger wiederholt43.

Alle Ergebnisse wurden mithilfe der Kruskal-Wallis-Analyse für nichtparametrische und einer einfaktoriellen ANOVA (Tukey posthoc) für parametrische Daten verglichen. Ergebnisse mit p-Werten von weniger als 0,05 wurden als statistisch signifikant angesehen. Statistische Analysen wurden mit der SPSS-Software, Version 20.0 (SPSS, Inc, Chicago, USA) durchgeführt.

Für die Tierversuche werden alle Methoden gemäß den von der Medizinischen Universität Teheran genehmigten Richtlinien durchgeführt. Dem aktuellen Projekt ist es gelungen, den Ethikkodex mit der Nummer (IR.UT.SCIENCE.REC.1400.003) von der Medizinischen Universität Teheran zu erhalten. Alle ethischen Fragen wurden während des Projekts gemäß den bestehenden Protokollen überwacht. Diese Studie wurde gemäß den ARRIVE-Richtlinien (https://arriveguidelines.org) durchgeführt.

Die Wechselwirkung zwischen Alginat und Fibrinogen wurde zunächst mithilfe der Fluoreszenzspektroskopie untersucht, die auf der intrinsischen Fluoreszenz von Fibrinogen bei drei verschiedenen Temperaturen von 25, 30 und 35 °C basierte. Den in Abb. S1 dargestellten Ergebnissen zufolge nahm die Fluoreszenzintensität mit steigender Alginatkonzentration bei den drei untersuchten Temperaturen deutlich ab. Um den Bindungsmechanismus von Alginat an Fibrinogen zu verstehen, wurden Fluoreszenzintensitätsdaten mithilfe der Stern-Volmer-Gleichung44 (Gleichung 6) analysiert.

wobei F0 und F die Fluoreszenzintensitäten von Fibrinogen in Abwesenheit bzw. Anwesenheit von Alginat sind; [Q] ist die Alginatkonzentration und Ksv ist die Stern-Volmer-Löschkonstante. Die Abbildungen S2 und S3 zeigen außerdem F0/F aufgetragen gegen [Q] bzw. log (F0–F)/F aufgetragen gegen log [Q]. Gemäß Tabelle S1 nehmen die Ksv-Werte mit steigender Temperatur ab, was darauf hindeutet, dass der Löschmechanismus von Fibrinogen durch Alginat ein statisches Löschen ist. Darüber hinaus wurden die Bindungskonstante (Kb) und die Anzahl der Bindungsstellen (n) von Fibrinogen für Alginat unter Verwendung der folgenden Gleichung44 (Gleichung 7) berechnet.

Dementsprechend wurde ein Wert von n von ungefähr 1 erhalten, was nahezu eine Bindungsstelle für Alginat auf dem Fibrinogen erkennen lässt. Darüber hinaus zeigte die Bindungskonstante bei steigender Temperatur einen abnehmenden Trend, was zeigen kann, dass die Bindungsstärke des Polymers und des Proteins mit steigender Temperatur abnimmt. Die standardmäßigen thermodynamischen Parameter wie Enthalpieänderungen (∆H°), Entropieänderungen (∆S°) und Gibbs-freie Energieänderungen (∆G°) der Wechselwirkung zwischen Fibrinogen und Alginat wurden mithilfe der folgenden Gleichungen41 ermittelt (Gl. 8, 9):

Basierend auf den aufgezeichneten Daten in Tabelle S1 waren die Werte von ∆H° und ∆S° beide < 0, was darauf hindeutet, dass die Wechselwirkung zwischen Alginat und Fibrinogen durch Van-der-Waals- und Wasserstoffbindungskräfte gesteuert wird45.

Die Wirkung von 0,4–1,3 μM Alginat auf die Fibrinogen-Sekundärstruktur wurde mithilfe der Fern-UV-Zirkulardichroismus-Spektroskopie (Wellenlänge 200–260 nm) untersucht (Abb. S4). Tabelle S2 zeigt den Inhalt der Sekundärstrukturelemente, wie er mit der CDNN-Software ermittelt wurde. Basierend auf den Ergebnissen wurde keine offensichtliche Veränderung in der Sekundärstruktur von Fibrinogen in Gegenwart von Alginat festgestellt, mit Ausnahme eines geringfügigen Anstiegs des Gehalts an α-Helices, der mit einer leichten Verringerung des Gehalts an Zufallsknäueln einherging46.

Die thermische Stabilität von Fibrinogen wurde in Gegenwart von Alginatliganden mittels UV-Vis-Spektroskopie untersucht. Basierend auf den Daten der Ultraviolett-sichtbaren Spektrophotometrie (Abb. S5) wurde festgestellt, dass Fibrinogen bis zu 42 °C, der maximalen Temperatur der chronischen Wunde, konformativ stabil blieb 47,48,49. Da die erste Schmelztemperatur (Tm) des Proteins bei etwa 59 °C beginnt, wird erwartet, dass das Protein seine Konformationsstabilität beibehält, wenn es an der Wundstelle platziert wird.

Das mit CaCl2 vernetzte Nisin enthaltende Alginat-Fibrinogen-Hydrogel (Alg-Fib@Nis-EDTA) war gleichmäßig, weich und halbopak. Das Hydrogel ließ sich leicht von der Glasplatte entfernen und zeigte eine glatte Oberfläche. Abbildung 2A,B zeigt ein Beispiel des vorbereiteten Hydrogels.

(A) und (B) Das gleichmäßige, weiche und halbopake Alg-Fib@Nis-EDTA-Hydrogel. (C) und (D) Rasterelektronenmikroskopie von Alg-Fib@Nis-EDTA-Hydrogel mit (C) 1 mm und (D) 100 µm Maßstabsbalken.

Die Morphologie des Alginat-Fibrinogen-Hydrogels wurde mittels Rasterelektronenmikroskopie (REM) untersucht (Abb. 2C, D). Das REM-Bild zeigte eine hochporöse Struktur, eine raue Oberfläche und große unregelmäßige Falten für das Hydrogel, was eine gute Übereinstimmung mit veröffentlichten Berichten über die hergestellten Hydrogele für Wundauflagen darstellt37. Die Durchmesser der Poren wurden im Bereich von 14–198 gemessen μm mit der Image J-Software. Dieser Porengrößenbereich ist basierend auf früheren Studien50,51,52 für die Zellanlagerung geeignet.

Abbildung 3A zeigt die FTIR-Spektren von Alginatpolymer und Alg-Fib@Nis-EDTA-Hydrogel. Das FTIR-Spektrum des Alginatpolymers zeigt Peaks bei 3470 und 1029 cm−1, bezogen auf –OH- bzw. –CO-Gruppen. Das Auftreten von Peaks bei 1620 und 1420 cm−1 kann symmetrischen bzw. asymmetrischen Zugschwingungen von –COO-Gruppen zugeordnet werden. Shehzad et. al.53 haben auch symmetrische und asymmetrische Zugschwingungen von –COO-Gruppen von Alginat berichtet, die den Peaks von 1630 und 1465 cm−1 entsprechen. Das FTIR-Spektrum des Alg-Fib@Nis-EDTA-Hydrogels zeigt auch alle wichtigen Peaks von Alginat. Allerdings nahm die Intensität des Peaks bei 3470 cm−1 aufgrund einer Reduzierung der OH-Gruppen bei der Bildung des Hydrogels ab. Darüber hinaus zeigte die Intensität der Peaks im Bereich von 1200–1500 cm−1 einen Anstieg, der auf die Zugschwingung der in Fibrinogen und Nisin vorhandenen –CN-Gruppen zurückzuführen sein kann. Diese Ergebnisse stimmen mit den vorherigen Ergebnissen54,55,56,57 überein.

(A) FTIR-Spektren von Alg-Fib@Nis-EDTA-Hydrogel und Alginatpolymer. (B) Die Quellprozentsätze des Alg-Fib@Nis-EDTA-Hydrogels im Laufe der Zeit bei verschiedenen Temperaturen. Der höchste Quellungsprozentsatz lag bei 240 (2244 ± 13 %), 200 (2229 ± 9 %) und 140 (2264 ± 17 %) Minuten nach der Inkubation bei 25, 37 bzw. 42 °C. Die Werte sind Mittelwerte ± SD, n = 3. SD: Standardabweichung. (C) Spannungs-Dehnungs-Diagramm der Hydrogele nach Quellung bei 25, 37 und 42 °C mit einer Dehnungsrate von 5 mm/min. (D) Freisetzungsprofil von Nisin aus Alg-Fib@Nis-EDTA-Hydrogel im Vergleich zu freiem Nisin zu verschiedenen Zeiten in PBS bei 37 °C. Datenpunkte sind Mittelwert ± SD, (n = 3). SD: Standardabweichung.

In Anbetracht der Bedeutung der Schwellung von Hydrogelen für die Erzielung eines guten Systems zur Medikamentenabgabe an die Wundstelle und der Tatsache, dass die Exsudation von Entzündungs- und Gewebeflüssigkeit den Heilungsprozess verlangsamt, führt ein Verband mit hoher Quellkapazität zur Absorption von Überschüssen Sekretionen und schnelle Wundheilung58. Daher haben wir das Quellverhalten von Alg-Fib@Nis-EDTA bei 25, 37 und 42 °C bewertet (Abb. 3B). Nach dem Eintauchen des Hydrogels in simulierte Wundflüssigkeit (SWF)59 wurde der Quellungsprozentsatz der Hydrogele zu verschiedenen Zeitpunkten bestimmt. Den in Abb. 3B dargestellten Ergebnissen zufolge führte eine Temperaturerhöhung nicht zu einem nennenswerten Unterschied in der Höhe des maximalen Quellungsprozentsatzes bei 25, 37 und 42 °C (ungefähr 2200 % bei den drei getesteten Temperaturen). Die steigende Temperatur führte jedoch dazu, dass die Hydrogelproben ihre maximale Schwellung in einem kürzeren Zeitraum erreichten (120 Minuten bei 42 °C im Vergleich zu 240 Minuten bei 25 °C). Salehi et al.51 berichteten von 342 ± 18 % nach 240 Minuten als maximale Schwellung des Hydrogels und anschließender Abnahme des Prozentsatzes der Schwellung. Sie spekulierten, dass die Wechselwirkung zwischen funktionellen Carbonsäuregruppen von Alginat und dem umgebenden hydrophilen Medium die Schwellung bewirken kann51. Außerdem wurde in einem Übersichtsartikel von Ching et al.60 festgestellt, dass mit zunehmender Temperatur die Struktur des Gels offener wird, die Größe der Poren und die Porosität des Gels zunehmen und infolgedessen die Die Steifigkeit des Gels nimmt ab. Dies steht im Einklang mit unseren Erkenntnissen aus der aktuellen Studie, denn mit steigender Temperatur erreicht das Hydrogel in kürzerer Zeit seine maximale Quellung, woraufhin sich die Gelstruktur zu öffnen beginnt und ihre starre Struktur verliert.

Wie in Abb. 3C dargestellt, nehmen die mechanischen Eigenschaften des entworfenen Hydrogels nach dem Quellen bei 25, 37 und 42 °C mit steigender Temperatur ab. Die höchste mechanische Stabilität (5,4 ± 0,1 kPa) des gequollenen Hydrogels wurde bei 25 °C festgestellt. Eine Erhöhung der Temperatur auf 37 °C verringerte die mechanische Stabilität (3,2 ± 0,1 kPa). Das gequollene Hydrogel zeigte die minimale mechanische Stabilität (2,4 ± 0,05 kPa) bei 42 °C. Es schien, dass das Öffnen der Struktur des Hydrogels beim Quellen zu einer Lockerung der Bindungen und einer geringeren mechanischen Stabilität führt.

Die Nisin-Einkapselungseffizienz wurde basierend auf Gleichung berechnet. (3) im Methodenteil als 93 ± 2,57 %. Darüber hinaus wurde die Nisinfreisetzung aus dem Alg-Fib@Nis-EDTA-Hydrogel bewertet (Abb. 3D). Basierend auf den Ergebnissen dauerte es 48 Stunden, bis fast das gesamte geladene Nisin (98,15 %) aus dem Hydrogel freigesetzt war. Allerdings zeigte das Hydrogel die höchste Nisinfreisetzungsrate während der ersten 6 Stunden (fast 50 %). Dagegen wurden nahezu 100 % des freien Nisins im gleichen Zeitraum (6 h) aus dem Dialysebeutel an die PBS-Lösung abgegeben. Die anfängliche schnelle Freisetzung des Arzneimittels aus dem Hydrogel kann darauf zurückgeführt werden, dass die Nisinmoleküle über Van-der-Waals-Kräfte und/oder Wasserstoffbrückenbindungen schwach mit den Hydrogeleinheiten oder Nisinmolekülen interagierten, die auf den oberflächlichen Teilen des Hydrogels geladen waren und schnell freigesetzt wurden das Hydrogel durch Diffusion beim Quellen des Gels61,62,63,64,65. Zohri et al.66 haben eine etwa 30-prozentige Freisetzung von Nisin aus Chitosan/Alginat-Nanopartikeln während der ersten Stunde und eine 85-prozentige Freisetzung in zwei Stunden beobachtet66. Andererseits berichteten Bernela et al.56, dass fast 60 bzw. 86 % des geladenen Nisins innerhalb von 24 bzw. 240 Stunden aus dem Alginat-Chitosan-Pluronsäure-Nanokomposit freigesetzt wurden.

Die Zytotoxizität von Alg-Fib@Nis-EDTA-Hydrogelen, die mit 0,03, 0,08 und 0,15 mM Nisin beladen waren, wurde in menschlichen A431-Epidermiszellen nach 24 und 48 Stunden mittels MTT-Assay bestimmt (Abb. 4). Den Ergebnissen zufolge induzierten die Hydrogele mit den getesteten Nisin-Konzentrationen keinerlei Anzeichen von Zytotoxizität in der untersuchten Epidermis-Zelllinie. Aufgrund der beobachteten Zytokompatibilität eignete sich das Alg-Fib@Nis-EDTA-Hydrogel für den nächsten Schritt unserer In-vivo-Studien an Ratten.

Lebensfähigkeit menschlicher A431-Epidermiszellen mittels MTT-Assay 24 und 48 Stunden nach der Zellbehandlung mit 0,03, 0,08 und 0,15 mM Alg-Fib@Nis-EDTA (Konzentrationen auf Nisinbasis). Die Zelllebensfähigkeiten werden auf die Kontrollzellen normalisiert und stellen den Mittelwert ± SEM dar. n = 3. SEM: Standardfehler des Mittelwerts.

Die antibakterielle Wirkung von Alg-Fib@Nis-EDTA-Hydrogel mit 0,03, 0,08 und 0,15 mM Nisin wurde gegen pathogene Stämme von Escherichia coli und Staphylococcus aureus als Vertreter gramnegativer bzw. grampositiver Bakterien gemäß dem genannten Verfahren bestimmt im Methodenabschnitt. Die Hemmzone wurde um unvernetzte und vernetzte Hydrogele herum beobachtet (Abb. 5). Wachstumshemmzonen von S. aureus und E. coli wurden gemessen und in Tabelle 1 dargestellt.

Hemmzonen um die vorbereiteten Hydrogele. (A–D) Nicht vernetzte und (E–H) vernetzte Hydrogele. Die Platten in (A), (C), (E) und (G) sind Escherichia coli-Kulturen. Die Platten in (B), (D), (F) und (H) zeigen Staphylococcus aureus-Kulturen. In jeder Platte enthalten die mit I–III nummerierten Hydrogele 0,03, 0,08 und 0,15 mM Nisin; Nummer IV stellt die Kontrollprobe dar. Bei den in (A) und (B) dargestellten Platten werden die Kontrollen aufgrund der Wiederholung bei den anderen 6 Platten vermieden.

Die durchschnittlichen Durchmesser der Hemmzonen in allen getesteten Nisinkonzentrationen für unvernetzte und vernetzte Hydrogele betrugen 17,2 ± 1,06 bzw. 14,3 ± 0,97 mm. Außerdem konnten die Hydrogele ohne EDTA (Alg-Fib@Nis) das Wachstum von E. coli nicht hemmen. Die Alg-Fib@Nis-Hydrogelproben mit 0,03 mM Nisin konnten das Wachstum von S. aureus nicht hemmen. Die Hemmzonen wurden in allen getesteten Nisinkonzentrationen um die Alg-Fib@Nis-EDTA-Hydrogele für die beiden Bakterienstämme mit vergleichbaren Durchmessern beobachtet. Die vergleichbare Hemmzone in allen getesteten Konzentrationen zeigt, dass das synthetisierte Hydrogel akzeptable antibakterielle Eigenschaften aufweist67. Hinsichtlich der technischen Einschränkungen des Hydrogels konnten wir keine signifikanten Unterschiede in der Wachstumshemmung feststellen, die durch verschiedene Konzentrationen von Nisin verursacht werden. Daher wurden MIC und MBC bestimmt, um genauere Daten zu erhalten.

Die aus MIC- und MBC-Tests erhaltenen Daten sind in Tabelle 2 aufgeführt. Nach unseren Erkenntnissen tötete und hemmte das Vorhandensein von Nisin in den untersuchten Konzentrationen im Alg-Fib@Nis-EDTA-Hydrogel das Wachstum sowohl von Gram-positiven als auch von Gram-negativen Tieren Bakterien. Alginat und Fibrinogen zeigten erwartungsgemäß keine antibakterielle Wirkung in Übereinstimmung mit Alboofetileh et al.68, die berichteten, dass Alginat weder auf grampositive noch auf gramnegative Bakterien eine antibakterielle Wirkung hatte. In einer anderen Studie berichteten Påhlman et al.69 über einen ähnlichen Mangel an antibakteriellen Eigenschaften von Fibrinogen. Darüber hinaus hatte EDTA nur bei gramnegativen Bakterien wie E. coli hemmende und tödliche Eigenschaften70.

Darüber hinaus hatte Nisin nach unseren Beobachtungen und parallel zu den veröffentlichten Berichten eine hemmende und tödliche Wirkung auf grampositive Bakterien (S. aureus)71. Basierend auf MHK- und MBC-Tests könnten 0,08 mM Nisin das Bakterienwachstum hemmen und 0,15 mM könnten S. aureus abtöten. Konzentrationen unter 0,08 mM (0,03 mM) konnten das Wachstum von S. aureus nicht hemmen. Allerdings könnten 0,03 mM Nisin S. aureus töten, wenn es in Form des Alg-Fib@Nis-Hydrogels angewendet wird. Interessanterweise könnten die untersuchten Nisinkonzentrationen, die im Alg-Fib@Nis-Hydrogel enthalten sind, gramnegative E. coli abtöten und ihr Wachstum hemmen. Dieses verstärkte Potenzial von Nisin, sowohl gramnegative als auch grampositive Bakterien abzutöten, könnte auf das Vorhandensein von EDTA in der endgültigen Hydrogelstruktur zurückgeführt werden, was die Wirkung von Nisin verstärken kann25.

Bei der Heilung von Hautwunden, insbesondere von tiefen Wunden, ist die Beschleunigung des Blutgerinnungsprozesses von besonderer Bedeutung. Die Fähigkeit eines Verbandes, den Blutgerinnungsprozess zu beschleunigen, kann mithilfe eines Blutgerinnungstests beurteilt werden72. Die Ergebnisse dieses Tests sind in Abb. 6 dargestellt. Gemäß Abb. 6 ist die Absorption von Hämoglobin in der Alg-Fib@Nis-EDTA-Hydrogelprobe deutlich geringer als in den anderen beiden Proben, die Gaze und Alg-Hydrogel enthalten, was darauf hindeutet höhere Fähigkeit des Alg-Fib@Nis-EDTA-Hydrogels bei der Bildung von Blutgerinnseln. Das Geschirr mit dem zum Spülen verwendeten Wasser wurde ebenfalls ausgestellt, um die bemerkenswerten Unterschiede zwischen den drei Proben zu zeigen.

In-vitro-Blutgerinnungstest. Die Absorption des Hämoglobins im Spülwasser wurde bei 540 nm gemessen. Die Bilder des Spülwassers aus den drei Proben Mullverband, Alg-Hydrogel und Alg-Fib@Nis-EDTA-Hydrogel werden angezeigt, um die bemerkenswerten Unterschiede zu verdeutlichen. Die Daten sind Mittelwerte ± SD (n = 3).

Um die Wirksamkeit des entwickelten Hydrogels bei der Wundheilung der Haut zu bewerten, wurde ein Tierversuch durchgeführt. Der Wundheilungsprozess wurde am 1., 3., 7., 14. und 19. Tag nach Entstehung der Wunde an der angegebenen Stelle überwacht. Die Bilder und Größen der Wunden sind in Abb. 7A dargestellt. In der Gruppe, die einen Alg-Hydrogel-Verband erhielt, wurden einige Infektionen und Entzündungen beobachtet und der Heilungsprozess verlief relativ langsam. Die gleiche Situation wurde in der Kontrollgruppe beobachtet, die nur mit steriler Gaze verbunden war. Während die mit Alg-Fib@Nis-EDTA-Hydrogel behandelte Gruppe keine Anzeichen einer Infektion zeigte und im Vergleich zur Kontroll- und Alg-Hydrogel-Gruppe einen verbesserten Genesungsprozess aufwies. Darüber hinaus wurde die Wundgrößenreduktion mithilfe von Gl. berechnet. 5, um den Wundheilungsprozess quantitativ zu bewerten, der in Abb. 7B dargestellt ist. Den Ergebnissen zufolge wies die Gruppe, die den Alg-Fib@Nis-EDTA-Hydrogel-Verband erhielt, am 7. Tag eine Heilung von 54,9 ± 13,3 % auf, während die Kontroll- und die Alg-Hydrogel-Gruppe am 7. Tag eine Heilung von 8,2 ± 1,7 % bzw. 30 ± 3,6 % aufwiesen gleiche Zeit. Früheren Studien zufolge deutet die Heilung von mehr als 50 % der Wunde innerhalb von 14 Tagen in der Gruppe mit Hydrogel-Verbänden auf die ordnungsgemäße Funktion des entwickelten Verbands hin73,74,75.

Ergebnisse der In-vivo-Wundheilung. (A) Makroskopisches Erscheinungsbild der Wunden, die am 1., 3., 7., 14. und 19. Tag nach der Verletzung behandelt wurden. (B) Histogramm zum Vergleich des Wundverschlusses am 1., 3., 7., 14. und 19. Tag nach der Verletzung. Die Werte stellen den Mittelwert ± SD, n = 3, *p < 0,05, **p < 0,01 und ***p < 0,001 dar. SD: Standardabweichung.

Außerdem ist die Wundheilung der Alg-Fib@Nis-EDTA-Hydrogel-Gruppe am 14. Tag höher als bei anderen Gruppen (97,9 % ± 0,2). Rezvanian et al.75 stellten einen mit Simvastatin beladenen Alginat-Pektin-Hydrogelfilm her und berichteten über den Prozentsatz des Wundverschlusses im Verlauf der 21-tägigen Behandlung. Schließlich erreichte die Hydrogel-Gruppe, die Simvastatin enthielt, 99,3 ± 0,5 %, während die Kontrollgruppe eine Verbesserung von 90 ± 0,0 % zeigte. Allerdings stellten sie bis zum 7. Tag des Experiments keine Besserung fest75. Während wir am 7. Tag des Experiments eine deutliche Verbesserung feststellen konnten.

Zur Beurteilung der Wirksamkeit eines Verbandes sind histopathologische Studien erforderlich. Durch diese Studien können verschiedene Stadien der Wundheilung beobachtet werden. Die histopathologische Analyse der Hautwunden wurde mittels H&E- und MT-Färbung durchgeführt, wie in Abb. 8 dargestellt. In der Kontrollgruppe zeigten die Wunden, die am 3., 7. und 14. Tag nach der Behandlung ohne jegliche Behandlung ausgewertet wurden, polymorphkernige (PMNs) Infiltration von Entzündungszellen und Bildung von Granulationsgewebe. Außerdem war die Wunde von einem verkrusteten Schorf bedeckt. Allerdings regenerierte sich die Epidermisschicht am 19. Tag teilweise. Die histopathologische Untersuchung der Alg-Hydrogel-Behandlungsgruppe am 3., 7., 14. und 19. Tag zeigte eine große Ähnlichkeit mit der Kontrollgruppe sowie das Vorhandensein schwerer Entzündungen und Granulationsgewebebildung, wie in Abb. 8 dargestellt.

(A) H&E und MT färbten mikroskopische Schnitte verheilter Schnitte in den verschiedenen Versuchsgruppen drei Tage nach der Behandlung. (B) H&E und MT färbten mikroskopische Schnitte verheilter Schnitte in den verschiedenen Versuchsgruppen 7 Tage nach der Behandlung. (C) H&E und MT färbten mikroskopische Schnitte verheilter Schnitte in den verschiedenen Versuchsgruppen 14 Tage nach der Behandlung. (D) H&E und MT färbten mikroskopische Schnitte verheilter Schnitte in den verschiedenen Versuchsgruppen 19 Tage nach der Behandlung. Schwarze Pfeile: Krustenschorf, Weiße Pfeile: Reepithelisierung.

Mikroaufnahmen der Alg-Fib@Nis-EDTA-Hydrogel-Behandlungsgruppe am 3. und 7. Tag nach der Behandlung zeigten eine schwere Entzündung und einen krustigen Schorf, der den Wundbereich bedeckte (Abb. 8A, B). Die Epidermisschicht hat in dieser Gruppe am 14. Tag begonnen, sich zu regenerieren, wie in Abb. 8C dargestellt. Interessanterweise nahm die Entzündungsreaktion am 19. Tag nach der Behandlung erheblich ab und es bildete sich eine vollständige Epithelschicht (Abb. 8D). Diese Gruppe zeigte mehr Ähnlichkeit mit normaler Haut, mit einer dünnen Epidermis und dem Vorhandensein normaler Netzwülste.

Die histomorphometrische Analyse wurde 3, 7, 14 und 19 Tage nach der Hautverletzung durchgeführt und die Ergebnisse sind in Tabelle 3 zusammengefasst. In allen Gruppen war die Reepithelisierung in der Alg-Hydrogel-Gruppe minimal und größtenteils mit unreifer Granulation gefüllt Gewebe. Die beste Reepithelisierung wurde in der Gruppe beobachtet, die Alg-Fib@Nis-EDTA-Hydrogel erhielt. Mithilfe der Masson-Trichrome-Färbung wurde das Ausmaß der Kollagenbildung im Gewebe untersucht (Abb. 9). Kollagen ist eines der wichtigsten Strukturproteine im Körper, das von Fibroblasten produziert wird und eine wichtige Rolle bei der Wundheilung und der Bildung von neuem Gewebe spielt. Basierend auf den erhaltenen Ergebnissen war der Kollagengehalt in der Alg-Fib@Nis-EDTA-Hydrogel-Gruppe im Vergleich zu Alg-Hydrogel- und Kontrollgruppen signifikant höher. Insgesamt war der Heilungsprozess in der Gruppe, die Alg-Fib@Nis-EDTA-Hydrogel erhielt, dem normaler Haut ähnlicher und zeigte das beste Erscheinungsbild. Lin et al.76 haben auch über eine Beschleunigung der Granulatproduktion und eine höhere Kollagenproduktion unter Verwendung eines Wundverbands auf Alginatbasis berichtet.

Repräsentative Grafik der Kollagendichte zu verschiedenen Zeitpunkten (3, 7, 14 und 19 Tage), die eine stärkere Wundheilung bei Alg-Fib@Nis-EDTA im Vergleich zu anderen Gruppen bestätigt. Diese Ergebnisse stimmten mit den Ergebnissen des Wundverschlusses überein. Die Werte stellen den Mittelwert ± SD, n = 3, p < 0,05, **p < 0,01 und **p < 0,001 dar. SD: Standardabweichung.

In diesem Szenario wurde ein Hydrogel auf Alginatbasis unter Verwendung von Fibrinogen, EDTA und Nisin zur Wundheilung entwickelt. Im ersten Schritt wurde die Wechselwirkung zwischen Fibrinogen und Alginat mithilfe spektroskopischer Techniken untersucht, um die Möglichkeit des Einsatzes von Fibrinogen im Hydrogel-Verband zu bewerten. Die erhaltenen Ergebnisse zeigten, dass die Fibrinogenkonformation durch das Alginat nur minimal beeinflusst wird und eine geeignete Option für die Vorbereitung des Verbandes sein kann. Im zweiten Schritt wurde das Alg-Fib@Nis-EDTA-Hydrogel hergestellt und charakterisiert. Verschiedene Eigenschaften des Hydrogels, darunter Bildung der gewünschten Bindungen, antibakterielle Beständigkeit, Quellung und Porosität, mechanische Beständigkeit, optimale Freisetzungsrate, Beschleunigung des Blutgerinnungsprozesses und Zellzytotoxizität, wurden bestimmt. Das konstruierte Gerüst absorbierte aufgrund der hohen Quellfähigkeit die Sekrete der Wundumgebung. Es zeigte sich auch die allmähliche Freisetzung von Nisin und vermutlich EDTA, was das Wachstum sowohl grampositiver als auch gramnegativer Bakterienarten hemmte. Es zeigte keine Toxizität gegenüber der Zelllinie der menschlichen Epidermis und zeigte auch eine sehr gute Funktion bei der Beschleunigung der Blutgerinnung. Basierend auf den In-vivo-Ergebnissen könnte das hergestellte Biokomposit-Hydrogel eine geeignete antibakterielle Wirkung haben, begleitet von einer geeigneten therapeutischen Wirksamkeit bei chronischen Wunden, indem es die Geschwindigkeit der Epithelisierungs- und Kollagenbildungsprozesse verbessert.

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Referenzen herunterladen

Die Autoren danken der Universität Teheran für die finanzielle Unterstützung dieses Projekts. Darüber hinaus danken die Autoren dem Labor für Biothermodynamik, dem Institut für Biochemie und Biophysik der Universität Teheran, für die freundliche Unterstützung während dieses Projekts, insbesondere Faezeh Moosavi-Movahedi, Mitra Pirhaghi und Mahmoud Karami Qoshabulaq.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Marjan Soleimanpour und Samaneh Sadat Mirhaji.

Institut für Biochemie und Biophysik, Universität Teheran, Teheran, Iran

Marjan Soleimanpour, Samaneh Sadat Mirhaji, Fatemeh Mamashli, Hadi Nedaei, Atiyeh Ghasemi, Maryam Sadat Nezamtaheri, Bahram Goliaei und Ali Akbar Saboury

Forschungszentrum für Pharmazeutische Wissenschaften, Gesundheitsinstitut, Medizinische Universität Kermanshah, Kermanshah, Iran

Samira Jafari & Hossein Derakhshankhah

Polymerlabor, Fakultät für Chemie, College of Science, Universität Teheran, Teheran, Iran

Mohammad Reza Karimi

Abteilung für Pharmazeutische Nanotechnologie, Fakultät für Pharmazie, Medizinische Universität Teheran, Teheran, Iran

Hamidreza Motasadizadeh und Yousef Fatahi

Abteilung für Erdölmikrobiologie, Akademisches Zentrum für Bildung, Kultur und Forschung (ACECR), Shahid Beheshti Universität, Teheran, Iran

Mohadese Khajezade

Fakultät für Neue Wissenschaften und Technologien, Universität Teheran, Teheran, Iran

Masoumeh Teimouri

Institut Universitaire de France (IUF), 1 Rue Descartes, 75005, Paris, Frankreich

Cedric Delattre

Clermont Auvergne University, CNRS, Clermont Auvergne INP, Pascal Institute, 63000, Clermont-Ferrand, Frankreich

Cedric Delattre

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MS und SSM beteiligten sich gleichermaßen an der Untersuchung, führten die Experimente durch, sammelten Daten und formalen Analysen und verfassten den ersten Entwurf des Manuskripts. SJ und HD trugen zur Datenkuratierung und -methodik bei. FM war bei den biophysikalischen Studien als Berater tätig und verfasste und redigierte den ersten Entwurf. HN beriet bei den spektroskopischen Methoden. MRK war an der Entwicklung von Materialien und Methoden für das Hydrogel und der Diskussion von FT-IR beteiligt. HM half bei In-vivo-Experimenten und der Diskussion dieses Teils sowie der Analyse histologischer Daten und führte die Studien zur Wundheilungsstatistik durch. YF beteiligte sich an der Durchsicht und Bearbeitung von Fotos und Grafiken des Artikels sowie an der Gestaltung der grafischen Zusammenfassung. AG stellte technische Unterstützung und Instrumente zur Verfügung, die für die Durchführung der spektroskopischen und thermodynamischen Studien erforderlich waren. MSN führte In-vitro-Zytotoxizitätsstudien (MTT) durch. MK und MT stellten Bakterienzellen zur Verfügung und beteiligten sich an den antibakteriellen Studien. BG und AAS betreuten und überprüften beide das Manuskript. CD beteiligte sich an der Durchsicht des Manuskripts und lieferte gute Kommentare. Alle Autoren haben das Manuskript überprüft und der endgültigen Fassung des Manuskripts zugestimmt.

Korrespondenz mit Samira Jafari oder Ali Akbar Saboury.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Soleimanpour, M., Mirhaji, SS, Jafari, S. et al. Entwicklung eines neuen Alginat-Fibrinogen-Biomaterial-Verbundhydrogels zur Wundheilung. Sci Rep 12, 7213 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-11282-w

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Eingegangen: 20. Dezember 2021

Angenommen: 29. März 2022

Veröffentlicht: 04. Mai 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-11282-w

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